Interacción de rotavirus con la proteína disulfuro-isomerasa in vitro y en sistemas celulares / Interaction of rotavirus with protein disulfide isomerase in vitro and cell system

Introducción. La entrada del rotavirus a la célula implica un mecanismo de múltiples pasos; las proteínas virales externas interaccionan con cuatro diferentes integrinas y Hsc70. Recientemente reportamos que la infección por rotavirus disminuye cuando se bloquea la proteína disulfuro-isomerasa de la superficie celular, lo que sugiere su interacción con el rotavirus en el proceso de entrada. Objetivo. Establecer la interacción del rotavirus con la proteína disulfuro-isomerasa en un sistema in vitro utilizando la proteína aislada de hígado bovino y, en un sistema celular, utilizando vellosidades intestinales de ratón y células MA104. Materiales y métodos. Se aisló la proteína disulfuro-isomerasa a partir de un homogenizado de hígado bovino utilizando anticuerpos anti-proteína disulfuro-isomerasa acoplados a agarosa mediante enlace hidrazona. La proteína disulfuro-isomerasa purificada se examinó por SDS-PAGE y Western blot y se utilizó para estudiar su interacción in vitro con rotavirus. Esta interacción se comparó con aquella observada en células MA104 y en las vellosidades intestinales de ratón. Resultados. La proteína disulfuro-isomerasa purificada mostró homogeneidad electroforética y fue capaz de unirse a rotavirus en un sistema in vitro. La interacción proteína-rotavirus fue detectada por ELISA de captura usando la proteína disulfuro-isomerasa bovina purificada y rotavirus de las cepas RRV y silvestre ECwt. La interacción de partículas de rotavirus purificadas con la proteína disulfuro-isomerasa celular se evidenció con ELISA, usando lisado celular después de la inoculación viral. Conclusión. La interacción rotavirus-proteína disulfuro-isomerasa fue demostrada in vitro, en células MA104 y en vellosidades intestinales de ratón lactante.

Introduction. Rotavirus entry process involves a multi-step mechanism, the first of which is when the outermost viral proteins interact with four different integrins and Hsc70. Recently, rotavirus infection reportedly has been decreased after blocking cell surface protein disulfide isomerase (PDI). This suggested that this protein interacts with rotavirus during the entry process. Objectives. The aim was to establish the rotavirus-PDI interaction in an in vitro system using PDI isolated from bovine liver, and in a cell system consisting of MA104 cells and mouse small intestinal villi. Materials and methods. Protein disulfide isomerase was isolated from a bovine liver homogenate using anti-PDI antibodies coupled to agarose through hydrazone bonds. Purity of purified protein was assessed by SDS-PAGE and Western blot. The purified PDI was used to study its in vitro interaction with the rotavirus particles. This interaction was compared with that taking place in MA104 cells and small intestinal villi isolated from sucking mice ICR. Results. The purified PDI showed an electrophoretic homogeneity and was able to bind rotavirus particles in vitro. Rotavirus-PDI interaction was detected by capture ELISA using purified protein and rotavirus strains RRV and wild-type ECwt. Interaction between rotavirus particles and cellular PDI was detected by ELISA using cell lysates after virus inoculation. Conclusions. Rotavirus-PDI interaction was demonstrated in vitro as well as in MA104 cells and intestinal villi from suckling mice.

Participation of the endoplasmic reticulum protein chaperone thio-oxidoreductase in gonadotropin-releasing hormone receptor expression at the plasma membrane

Chaperone members of the protein disulfide isomerase family can catalyze the thiol-disulfide exchange reaction with pairs of cysteines. There are 14 protein disulfide isomerase family members, but the ability to catalyze a thiol disulfide exchange reaction has not been demonstrated for all of them. Human endoplasmic reticulum protein chaperone thio-oxidoreductase (ERp18) shows partial oxidative activity as a protein disulfide isomerase. The aim of the present study was to evaluate the participation of ERp18 in gonadotropin-releasing hormone receptor (GnRHR) expression at the plasma membrane. Cos-7 cells were cultured, plated, and transfected with 25 ng (unless indicated) wild-type human GnRHR (hGnRHR) or mutant GnRHR (Cys14Ala and Cys200Ala) and pcDNA3.1 without insert (empty vector) or ERp18 cDNA (75 ng/well), pre-loaded for 18 h with 1 µCi myo-[2-3H(N)]-inositol in 0.25 mL DMEM and treated for 2 h with buserelin. We observed a decrease in maximal inositol phosphate (IP) production in response to buserelin in the cells co-transfected with hGnRHR, and a decrease from 20 to 75 ng of ERp18 compared with cells co-transfected with hGnRHR and empty vector. The decrease in maximal IP was proportional to the amount of ERp18 DNA over the range examined. Mutants (Cys14Ala and Cys200Ala) that could not form the Cys14-Cys200 bridge essential for plasma membrane routing of the hGnRHR did not modify maximal IP production when they were co-transfected with ERp18. These results suggest that ERp18 has a reduction role on disulfide bonds in wild-type hGnRHR folding.

Contribuiçäo ao conhecimento das lesöes de estocagem: estudo do sistema de óxido-reduçäo glutationa dependente em eritrócitos coletados em CPDA-1 / Contribution on knowledge of storage lesions: glutathione anti-oxidant system study

A presente investigaçäo teve como objetivo o estudo do sistema de óxido-reduçäo glutationa-dependente em 34 CGV coletados em CPDA-1, nos dias 0 e 35 de estocagem. Amostras de 12 CGV foram examinadas logo após a coleta em heparina e CPDA-1, constituindo o grupo dia 0. Os valores do dia 0 foram considerados controles para 12 CGV examinados no 35§ dia de estocagem. Foram efetuados testes de reduçäo da MetaHb pelo Am (atividade G6PD) e pela CIS (atividade GSSG-Rd), dosagens de GSHt, GSSG, MDA total e eritrocitário, MetHb e Hb plasmática. Os resultados do dia 0 demonstraram preservaçäo da capacidade antioxidante da via das pentoses. Foi também observada uma lesäo incipiente da membrana, principalmente após centrifugaçäo refrigerada em GV heparinizados. No dia 35, constatou-se atividade deficiente da G6PD, deficiência de GSSG-Rd (funcional, dependente da atividade G6PD), diminuiçäo da GSHt, da GSSG, manutençäo da relaçäo [GHS] / [GSSG], refletindo uma lentidäo na capacidade antioxidante da vida das pentoses. Pelos altos níveis de Hb plasmática, ficou evidenciada uma importante lesäo da membrana, associada entretanto, a níveis pouco elevados de MDA. Estes CGC que sofreram manipulaçäo eventual e freqüênte, durante a estocagem, foram comparados a 4 unidades de CGV estocados imóveis pelo mesmo período, para GSHt e atividades G6PD e GSSG-Rd. As unidades agitadadas apresentaram o dobro das taxas de GSHt, sugerindo que a agitaçäo favorece maior síntetse e também maior reciclagem da GSH. A atividade G6PD foi menor, embora näo significante, nas unidades agitadas, provavelmente pela oxidaçäo dos seus grupamentos SH, pois um maior fluxo de oxigênio ocorre no interior da bolsa. A GSSG-Rd acompanhou funcionalmente a deficiência em G6PD. Foram estudados 10 CGV estocados imóveis por 35 dias, 6 de 150 ml e 4 de 300 ml, comparando-se amostras de GV do topo, centro, fundo da bolsa e após mistura completa do conteúdo, para alguns índices hematimétricos, GSHt e atividades G6PD e GSSG-Rd. A camada do fundo dos CGV demonstrou ser a mais compacta e menos preservada, com GV de menor VCM, maior CHCM e menores níveis de GSHt. A camada do centro foi a melhor preservada, tanto quanto a índices hematimétricos, quanto a taxas de regeneraçäo de GSHt e níveis mais homogêneos de G6PD. Nestas unidades imóveis, parece ocorrer um "choque metabólico", quando da mistura dos GV com plasma, proteases, oxigênio e espécies oxigênio reativas, pois a regeneraçäo da GSHt é semelhante...